在传统的小分子药物研发中，决定靶点特异性与DMPK（分布、代谢和药代动力学）的结构特征往往密不可分，很难相互独立的进行设计和优化。与之不同，寡核苷酸类药物的药效团和药代动力学性质在理论上可以分别优化，这是因为寡核苷酸类药物的核苷序列直接决定前者，而其磷酸酯骨架的化学性质很大程度上影响后者。目前，寡核苷酸类药物有超过155项正在进行的临床试验，并已有多个获批上市的药物，其中大部分都含有修饰的磷酸酯骨架。遗憾的是，尽管有机合成的进步对现代药物化学的发展产生了深远的影响，但是随着寡核苷酸序列和可能的磷酸酯骨架的范围扩大，寡核苷酸合成的基本化学却鲜有重大进步。如图1所示，一段含有四种不同磷基连接结构以及多种糖骨架的嵌合寡核苷酸序列，如果使用已有方法合成，所面临的巨大困难也从某种程度上凸显了现有方法的局限性，理想中可以随意地以任何顺序安装更广泛的组合和变化就显得更加遥不可及。如此说来，寡核苷酸的商业化，更具体地说，广受期待的硫代磷酸酯反义寡核苷酸（PS-ASO）的商业化面临着重大挑战。

2018年，美国斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute，TSRI）的Phil S. Baran教授与制药巨头百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb，BMS）的Ivar M. McDonald、Martin Eastgate、Michael Schmidt等研究者合作发展了一种基于P(V)的磷硫试剂（称为PSI或ψ）来解决立体纯硫代磷酸酯（R-PS和S-PS，主要在DNA环境下）寡核苷酸的合成问题（Science, 2018, 361, 1234–1238，点击阅读详细）。然而，这项初步研究也有尚未解决的问题，比如其他类型磷酸酯骨架连接结构如二硫代磷酸酯和天然磷酸二酯的安装，如锁核酸（LNA）的其他糖化学，以及对现代自动化合成的适用性。解决这些问题，要面对不少挑战，比如：1）P(V)试剂曾被认为反应速率过于缓慢，无法与P(III)歧化相竞争；2）鸟嘌呤和胸腺嘧啶碱基的影响会导致不同的化学选择性；3）使用现有基于P(III)的试剂来安装二硫代磷酸酯连接结构并不理想；4）当前修饰磷酸酯骨架的方法步骤复杂，存在氧化与脱保护以及产物分离等问题。鉴于此，开发一种高度选择性和兼容性的自动化寡核苷酸合成方法就显得尤为重要，会对寡核苷酸类药物的研发和商业化产生深远影响。

在此前工作基础上，Baran教授等人近日再获重要进展。通过利用ψ2（3）、rac-ψ（4）和ψO（5）三种新试剂，并与已报道的[(+)-ψ, (+)-2]和[(−)-ψ, (−)-2]体系相结合，他们开发了一种完全不同于P(III)基寡核苷酸合成的通用P(V)平台，实现了特定寡核苷酸序列的任意受控合成（图1C）。该方法不仅能够减少保护基化学的依赖、特殊试剂、氧化试剂等多个方面的问题，而且还去掉了标准固相寡核苷酸合成（SPOS）方案中的一个完整步骤（即磷氧化过程）。相关成果于近日发表在Science上。

相比于ψ2与ψO的合成，rac-ψ的合成相对简单，以环氧环己烷为原料类比ψ即可获得。为此，作者对含有二硫代磷酸酯ψ2和天然磷酸二酯的ψO试剂的合成进行了探索（图2）。尽管1995年化学家报道了二硫代磷烷（dithiaphospholanes）可以安装在核苷上并与其偶联，以合成含有二硫代磷酸酯连接结构的二核苷酸，但是安装硫需要单独的氧化步骤以及有毒且不稳定（爆炸性）的试剂（图2A）。鉴于此，作者以去除氧化步骤和危险试剂为目的，选择P(V)为中心来设计合成二硫代磷酸酯ψ2。在确定最佳离去基团与环大小两个因素后，作者发现廉价的P2S5可以与五氟苯酚结合，然后用环硫乙烷与P(V)中间体（6）进行反应，能够大规模（>100 g）地合成含有二硫代磷酸酯结构的ψ2（3）。类似地，作者评估了近30个不同骨架以及3个不同离去基团，其中骨架优化系统地评估了环大小、取代基、电子效应以及立体化学对位阻、偶联和整体稳定性的影响，并发现ψO是唯一可行的试剂。随后，作者以简单、可规模化（>50 g）的步骤合成了ψO试剂（图2A）。具体而言，廉价的P2S5与4-溴苯硫酚进行反应得到P(V)中间体（7），后者与氢化cis-柠檬烯环氧化物（8）结合生成PS试剂（9），最后经SeO2脱硫便可获得ψO（5）。

接下来，作者将P(V)平台与目前最先进的P(III)方法进行了比较（图2B），结果显示P(V)平台比P(III)方法步骤更简便、产物纯度更高（>99%）且不会产生PS杂质。为了进一步测试和对比两个平台的优缺点，作者对混合PO-PS主链的合成进行了探索。以P(III)方法为例，PS二聚体（13）与PA-dT（18）发生亚磷酰胺偶联反应得到被保护的三聚体（14），后者经氧化得到目标产物和脱硫副产物的混合物。相比之下，使用氧化还原中性P(V)方法则能够成功地制备未保护的混合PS-PO三聚体（19），同时没有任何硫损失。

这种P(V)方法要面临的另一个大挑战是能否克服经典P(V)试剂较慢的偶联速率问题，以适应传统的自动化寡核苷酸合成方案。作者基于P(V)全套试剂，采用动力学研究评估了P(V)平台的偶联性能，结果显示经典的基于P(V)的磷酸三酯方法非常缓慢（图2C，橙色条），而本文详述的P(V)试剂平台与行业标准P(III)方案的性能相同，所有反应均在两分钟内达到完全转化。

在过去的30多年里，基于亚磷酰胺合成的SPOS方法得到了不断优化。尽管其中一些方法或许也可继续使用，但在某些方面现有解决方案与P(V)合成方法并不兼容（图3A）。目前，通用的载体对于1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）不够稳定，为此作者使用 Pya 保护基代替标准的酰胺保护基，开发了一种稳定性显著改善的通用载体（20，图3B）。同时，当对胸苷使用Pom保护时，也获得了更好的结果。其次，作者在确定所有P(V)试剂的化学选择性和相对偶联速率后，对氧化还原中性P(V)平台在自动化 SPOS 上的效率进行了系统的研究。第一步，树脂结合核苷的DMT基团去保护得到游离的5ʹ-醇，后者与P(V)的核苷酸进行反应，随后发生封盖和解封步骤完成了固相循环，并为下一次偶联奠定了基础。

接下来就是合成的实战检验。任何新试剂系统要用于寡核苷酸合成平台，必须先证明在使用单一方案制备不同序列的情况下仍能保持高保真度和稳健性。为了检验新P(V)平台的成色，作者设计了一种寡核苷酸分子结构“矩阵”，以将所有可能的核碱基（A、C、G、T）和糖（DNA和LNA）组合引入到3-10-3 DNA/LNA gapmer框架上，这也是目前RNase H激活反义寡核苷酸中最先进的技术（图3C）。无论P(V)单体是用于评估该方法的通用性还是用于序列特异性优化，作者使用的均是单一方案。首先，作者测试了这种方法的通用性，合成了具有交替（21, 22）和连续立体化学结构（23-26）的均质、手性PS-ASO。值得一提的是，这种使用氧化还原中性P(V)基试剂的方法是第二个工业上可行的生产立体纯PS-ASO的平台。随着这一重要目标的达成，作者开始将 PO2 连接结构引入这些分子结构中，以高纯度获得了嵌合序列（27-30），合成过程中硫没有实质性的损失。接下来，作者制备了同时带有PS和 PS2连接结构（31-34）的寡核苷酸序列以及含有所有四种可能连接结构的寡核苷酸序列（35, 36）。最后，为了证明这种P(V)寡核苷酸合成平台的优势，作者基于ψ 的衍生物rac-ψ（图1），在该平台上合成了外消旋PS寡核苷酸（37、38）（图3D）。

总结

寡核苷酸疗法能够直接调控基因表达，被认为是继小分子药物和蛋白质类药物之后的新一类药物开发热点方向。迄今为止，已被研究的寡核苷酸修饰数量十分有限，在临床中的应用甚至更少，说到底，原因还是在于合成水平跟不上。基于P(V)试剂合成寡核苷酸早已有之，但由于化学选择性低及反应性差等问题而无法担当大任。Baran教授等人的这项工作可以说使P(V)策略焕发新生，让人们获得希望的寡核苷酸嵌合序列成为可能。更有意义的是，这一P(V)平台兼容商用的寡核苷酸自动化固相合成系统，应用前景光明。尽管该平台分离收率（12-27%）还不算太高，但经过一定的优化，未来应该也不会是太大问题，即便在现在，这个水平的收率也足以支持药物化学的实验室研究。